必利網食用色素按其来源可分为食用天然色素和食用合成色素两大类。食用色素食用天然色素是人工从有色的动、植物体内提取，合成经进一步分离精制而成。测定合成色素因其着色力强，食用色素易于调色，人工在食品加工过程中稳定性能好，合成价格低廉，测定在食用色素中占主要地位。食用色素目前，人工国内外使用的合成食用色素绝大多数都是食用合成色素。合成色素主要来源于煤焦油及其副产品，测定且在合成过譬皇?食用色素能受铅、砷等有害物质污染，人工因此在使用的合成安全性上，其争论要比其他类的食品添加型要岁突出和尖锐。中国许可使用的合成色素有9种：苋菜红、胭脂红、诱惑红、新红、柠檬黄、日落黄、靛蓝、亮蓝、赤藓红。前6种为偶氮类化合物，使用中占绝大多数。食用合成色毒的测定方法主要有薄层色谱法和高效液相色谱法。下面介绍高效液相色谱法测定食用合成着色剂。
1、原理
食品中人工合成着色剂用聚酰胺吸附法或液-液分配法提取，制成水溶液，注入高效液相色谱仪，经反相色谱分离，根据保留时间定性，与峰面积比较进行定量。
2、试剂
①盐酸。
②乙酸。
③正己烷。
④甲醇：经滤膜(O.5μm)过滤。
⑤酰胺粉(尼龙6)：过200目筛。
⑥乙酸铵溶液0.02m01/L。称取1.54g乙酸铵，加水至1000mL溶解，经0.45μm滤膜过滤。
⑦水取2mL氨水，加水至100mL混匀。
⑧水一乙酸铵溶液0.02mol/L。取氨水0.5mL加乙酸铵溶液(O.02mot／L)至1000mL混匀。
⑨甲醇一甲酸溶液6+4。取甲醇60mL，甲酸40mL混匀。
⑩柠檬酸溶液：取20g柠檬酸(C6H807·H20)加水至100mL，溶解混匀。
⑪无水乙醇-氨水-水溶液7+2+1。取无水乙醇70mL、氨水20mL、水lOmL混匀。
⑫三正辛胺正丁醇溶液 5％。取三正辛胺5mL，加正丁醇至100mL混匀。
⑬饱和硫酸钠溶液。
⑭硫酸钠溶液：2g／L。
⑮pH6的水水加柠檬酸溶液调pH6。
⑯合成着色剂标准溶液准确称取按其纯度折算为100％质量的柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝各0.100g，置于lOOmL容量瓶中，加pH6的水到刻度，配成水溶液(1.00mg／mL)。
⑰合成着色剂标准使用液 临用时将上述溶液加水稀释20倍，经0.45μm滤膜过滤。配成每毫升相当于50.0μg的合成着色剂。
3、仪器
高效液相色谱仪，带紫外检测器，254nm波长。
4、操作方法
(1)样品处理
①橘子汁、果味水、果子露汽水等：称取20.O～40.Og放入100mL烧杯中。含二氧化碳样品加热驱除二氧化碳。
②配制酒类：称取20.0～40.0g放入100mL烧杯中，加入小碎瓷片数片，加热驱除乙醇。
③硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00～10.OOg，粉碎样品，放入100mL小烧杯中，加水30mL，温热溶解，若样品溶液pH较高，用柠檬酸溶液调pH至6左右。
④巧克力豆及着色糖衣制品：称取5.00～10.OOg，放入100mL小烧杯中，用水反复洗涤色素，至巧克力豆无色素为止，合并色素漂洗液为样品溶液。
(2)色素提取
①聚酰胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH为6，加热至60℃，将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂熔漏斗抽滤，用60℃pH 4的水洗涤3～5次，然后用甲醇一甲酸混合溶液洗涤3～5次(含赤藓红的样品用液一液分配法处理)。再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL。经滤膜(O.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。
②液-液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，直到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸铵溶液洗两次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL，合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗两次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL。经滤膜(0.45μm)过滤，取10μL进高效液相色谱仪。
(3)高效液相色谱参考条件
①色谱柱：YWG-Cl810μm不锈钢柱4.6mm(内径)×250mm。
②流动相：甲醇-O.02m01/L乙酸铵溶液(pH 4)。
③梯度洗脱：甲醇20％～35％，5min；35％～98％，5min；98％继续6min。
④流速：1mL/min。
⑤紫外检测器：254nm波长。
(4)测定:取相同体积样液和合成着色剂标准使用液分别注入高效液相色谱仪，根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
5、结果计算式中：
Xi——样品中着色剂的含量，g/kg；
Ci——样液中着色剂的质量，μg；
V2——进样体积，mL；
V1——样品稀释总体积，mL；
m——样品质量，g。
6、说明
①最小检出量：新红5ng，柠檬黄4ng，苋菜红6ng，胭脂红26ng。
②允许相对误差≤10％。
③样品不含赤藓红时，用聚酰胺吸附法；含赤藓红时，用液-液分配法
④测定一个样品后，将甲醇流动相恢复至20％，使之稳定20min后，再开始测定第二个样品。
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相关链接：苋菜红，诱惑红，柠檬黄，亮蓝
